بررسی جایگاه درون سلولی آنزیم ‏‎sk1-1/s1p‎‏ در لاین سلولی ‏‎cos-7‎‏ ترانسفکت شده با وکتور ‏‎pires-hski-v5‎‏

آنزیم ‏‎site-1-protease/subtilisin-kexin isozyme-1)sip/ski-1‎‏) پروتئازی است که بر خلاف ‏‎precursor convertase)pc‎‏ )های پستانداران ، سوبسترای خود را پس از آمینواسید های هیدروفوب درتوالی ‏‎x‎‏- ‏‎arg/lys)-x-(hydrophobic)-(l,t)‎‏)برش می دهد. به نظر می رسد که آنزیم در ‏‎er‎‏، دستگاه گلژی و یا وزیکول های ترشحی وجود دارد، ولی احتمالا در دستگاه گلژی فعالیت خود را انجام می دهد. مشخص نمودن جایگاه درون سلولی آنزیم ‏‎sip/ski-1‎‏ در لاین سلولی ‏‎cos-7‎‏ هدف اصلی این تحقیق بوده است. پس از تکثیر ژن مورد نظر به روش ماکسی پرپ، سلولهای ‏‎cos-7‎‏با رکتور پلاسمیدی (حاوی ‏‎dna‎‏‏‎c‎‏ی کدکننده ‏‎sip/ski-1-v5‎‏ ) ترانسفکت شد و از آنجایی که ‏‎cdna‎‏ی پروتئین ‏‎egfp‎‏ در وکتور به عنوان گزارشگر حضور داشت، به روش فلورسانس میکروسکوپی و نیز روش فلوسیتومتری سطح بیان و درصد سلولهای ترانسفکت شده مشخص شد. وجود سیگنال مثبت در تصاویر میکروسکوپ فلورسنت انجام دادن موفقیت آمیز ترانسفکشن را تایید کرد. برای اثبات بیان شدن ‏‎sip/ski-1‎‏ ، واکنش ‏‎rt-pcr‎‏ انجام شد. سپس ایمنوهیستوشیمی بر روی تک سلولی ترانسفکت شده با استفاده از آنتی بادی بر علیه وصله ‏‎v5-tag‎‏ که به قسمت ‏‎c-terminal‎‏ ژن اضافه شده است انجام شد. نتایج حاصل از ایمنوهیستوشیمی نشان داد که آنزیم در ساختارهایی شبیه ‏‎er‎‏ و دستگاه گلژی قرار دارد اما توزیع رنگ آمیزی در اطراف هسته بیشتر از قسمتهای دیگر است. مشاهده سلولهای سبز رنگ با میکروسکوپ فلورسنت، نشان داد که استفاده از روش لیپوفکشن برای انتقال ژن به سلولهای کشت داده شده پستانداران موفق بوده است. الگوی رنگ آمیزی در ایمنوهیستوشیمی ضمن اینکه فرضیات قبلی را در مورد محل استقرار درون سلولی آنزیم تایید می کند، پیشنهاد می کند که آنزیم در ‏‎er‎‏ و دستگاه گلژی قرار دارد و فعالیت می کند.